1. (2021·江苏) 某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：

1. （1） 目的基因的扩增

   ①提取真菌细胞，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。

   ②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致。

   ③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有

   A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃

   B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物

   C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸

   D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性

3. （2） 重组质粒的构建

   ①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及酶等，完成质粒的环化。

   ②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在。

5. （3） 融合蛋白的表达

   ①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是。

   ②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag标签，说明，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。